PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程常見問題解答

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。PCR技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率達(dá)不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴(kuò)增到106倍，足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)展開。

PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程常見問題解答如下：
1. 如何有效設(shè)計(jì)引物
（1）使用Oligo或Primer設(shè)計(jì)引物，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，長(zhǎng)度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
2. PCR電泳無擴(kuò)增條帶
（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。
（6）引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（7）DNA凝膠電泳時(shí)加入陽性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。
3. PCR產(chǎn)物量過少
（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。
（4）引物量不足。增加體系中引物含量。
（5）延伸時(shí)間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時(shí)間。
（6）變性時(shí)間過長(zhǎng)。變性時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
4. 擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。
（4）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。
（6）循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
（7）退火溫度過低。
（8）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。
（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。
5. 擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶（雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。
（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。
（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。
（5）樣品處理不當(dāng)。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。
（8）復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。
（9）反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。
（11）引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。
6. 陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶
（1）試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
7. 條帶大小與理論不符
（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。
（2）模板或引物使用錯(cuò)誤。查看引物是否會(huì)擴(kuò)增部分條帶和模板是否正確。
3)基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。
8. 持續(xù)出現(xiàn)假性條帶
（1）起始退火溫度太低，或目的擴(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的T值相差不大?？蓢L試適當(dāng)提高PCR溫度或者設(shè)置降落PCR，降低循環(huán)數(shù)。
9. 菌落PCR檢測(cè)有條帶，接種大搖后無條帶
（1）可重新以菌落和菌液為模板進(jìn)行PCR對(duì)照檢測(cè)，因?yàn)榫?/span>PCR的假陽性概率還是比較高。如果仍出現(xiàn)上述結(jié)果，推測(cè)可能是平板上連接液中的未連接載體的擴(kuò)增引起的目的條帶，進(jìn)一步質(zhì)粒PCR檢測(cè)，可證明目的片段是否真正連接成功。